近日，“European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging”杂志在线发表了华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科兰晓莉教授团队与华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系雷萍教授课题组合作的题为“Noninvasive longitudinal PET/CT imaging of CAR T cells using PSMA reporter gene”的最新研究成果。该研究在国家自然科学基金重点项目、核素分子影像探针研发与转化科技创新团队（湖北省科技创新团队）与湖北省自然科学基金重点项目（创新群体）的共同支持下完成。协和医院核医学科兰晓莉教授为该论文的通讯作者。宋祥铭博士和张怡蕊博士为共同第一作者。
原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s00259-023-06508-6
研究背景介绍
恶性肿瘤疾病严重威胁我国人民生命健康。在肿瘤治疗领域，嵌合抗原受体修饰的T细胞，即CAR-T细胞免疫疗法在血液肿瘤治疗上大放异彩。CAR-T细胞免疫疗法通过将体外制备好的CAR-T细胞回输到患者体内，经过体内循环，靶点识别，从而发挥杀伤肿瘤细胞的功能。目前CAR-T疗法在实体瘤治疗上面临巨大挑战，影响其疗效与预后有两个关键问题：如何判断CAR-T细胞是否有效归巢和浸润肿瘤组织，如何评价CAR-T细胞在肿瘤局部的存活、增殖和代谢情况。
核医学分子影像技术为无创实时监测CAR-T细胞提供最直接的可视化证据。报告基因显像利用报告基因与转染T细胞的CAR框共表达，既可进行CAR-T细胞的特异性显像，也可以实现长期监测CAR-T细胞的目的，本研究选择报告基因显像方法监测CAR-T细胞。
因此，本研究中我们构建以截短前列腺特异性膜抗原（truncated prostate specific membrane antigen，ΔPSMA）为报告基因的靶向转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）的TfR CAR-ΔPSMA T（简称为CAR-ΔPSMA T）细胞。转铁蛋白受体在多种恶性肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织中表达较低。TfR是CAR-T细胞疗法的良好靶点。PSMA报告基因系统用于CAR-T细胞成像，相关核素靶向探针研究广泛，临床转化较为简单。我们构建PSMA截短体（ΔPSMA），既保证其对探针的结合能力；同时去除胞内信号转导部分，减少对CAR-T细胞的功能影响。
研究内容
01. CAR-ΔPSMA T靶点表达验证、活化与杀伤功能鉴定
引入报告基因后，CAR-ΔPSMA T细胞能识别靶细胞并活化，实现对肿瘤细胞的杀伤。
图1. CAR-ΔPSMA T细胞的构建示意图和体外表征。
（A）CAR分子构建表达框的示意图。（B）CAR-ΔPSMA T细胞表面靶点流式细胞术分析。（C）CAR-ΔPSMA T细胞在30分钟（左图）和60分钟（右图）对[68Ga]Ga-PSMA-617的细胞摄取（n=6）。（D）将CAR-ΔPSMA T细胞与TfR+血液系统恶性肿瘤细胞（K-562细胞与Molt-4细胞）共孵育后，按照CD3+、CD4+和CD8+ T细胞群进行门控分组，测定活化标记CD25和CD69在其中的表达。（E）将CAR-ΔPSMA T细胞与TfR+ MCF-7和TfR- MX-1乳腺癌细胞共孵育后，按照CD3+、CD4+和CD8+ T细胞群进行门控分组，测定活化标记CD25和CD69在其中的表达。（F）CAR-ΔPSMA T细胞对Molt-4和K-562肿瘤细胞的杀伤鉴定。（G）CAR-ΔPSMA T细胞对MCF-7和MX-1肿瘤细胞的杀伤鉴定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
02. [68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT对CAR-T细胞探测限度研究
[68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT在体内和体外以高灵敏度检测CAR-ΔPSMA T细胞。在小鼠双侧肩部注射指定数量的CAR-ΔPSMA T细胞（白色箭头所指，1K=103，1M=106）。[68Ga]Ga-PSMA-617检测限为100个细胞/mm3。体外检测限为250个细胞/mm3（n=6）。
图2. [68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT在体内外示踪CAR-ΔPSMA T细胞。
（A）在小鼠双侧肩膀注射不同数量的CAR-ΔPSMA T细胞后的PET/CT显像。（B）定量分析。（C）铺板实验。（D）铺板实验定量分析。
03. [68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT对CAR-T细胞示踪的特异性研究
构建MCF-7荷瘤鼠模型。实验组尾静脉注射CAR-ΔPSMA T细胞（ΔPSMA+），对照组则注射CAR-EGFR T细胞（ΔPSMA-组）。两组肿瘤的[68Ga]Ga-PSMA-617基线摄取相似；在注射细胞后的第1天与第3天，两组肿瘤的探针摄取均未有显著差异。在注射细胞后第7天，实验组显示肿瘤部位的[68Ga]Ga-PSMA-617摄取与肿瘤/肌肉比值（T/M）显著升高。[68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT特异性示踪体内的CAR-ΔPSMA T细胞。
图3. 对比研究验证[68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT示踪CAR-ΔPSMA T细胞的特异性。
（A）实验流程。（B）注射CAR-ΔPSMA T细胞（ΔPSMA+组）或CAR-EGFR T细胞（ΔPSMA-组）的MCF-7皮下瘤小鼠中[68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT MIP图像（n=3）。肿瘤部位用白色箭头标记。（C）肿瘤部位[68Ga]Ga-PSMA-617摄取分析。两组肿瘤摄取[68Ga]Ga-PSMA-617的肿瘤与血池比值T/B分析（D）和肿瘤与肌肉比值T/M分析（E）。
04. [68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT对CAR-T细胞进行序贯监测
实验组是给予CAR-ΔPSMA T细胞的MCF-7荷瘤鼠，对照组是给予的未经转染的空白对照T细胞与注射PBS的MCF-7荷瘤鼠。在给予细胞前进行基线PET/CT显像，注射细胞后第1、3、7和14天进行监测。显示三组肿瘤的[68Ga]Ga-PSMA-617基线摄取相似；在注射细胞后的第1天与第3天，三组肿瘤部位的探针摄取未有显著差异。在注射细胞后第7天，CAR-ΔPSMA T组对肿瘤的摄取相较于Blank T组与PBS组出现显著升高，至注射细胞后第14天，CAR-ΔPSMA T组肿瘤内的摄取进一步增高（图4）。实验组肿瘤部位的人源CD3和CD45染色显示CAR-ΔPSMA T细胞主要浸润在肿瘤边缘，肿瘤中心出现大面积坏死区域（图5）。对照组未见T细胞浸润，且未见肿瘤杀伤坏死。外周血与肿瘤的流式显示实验组的CD3+ T细胞的比例显著高于对照组（图6）。
图4. [68Ga]Ga-PSMA-617 PET/CT对CAR-ΔPSMA T细胞进行序贯监测。
（A）显像流程图。（B）序贯监测PET/CT MIP图像。（C）肿瘤部位[68Ga]Ga-PSMA-617摄取定量分析。（D）肿瘤/血池比值分析。（E）肿瘤/肌肉比值分析。
图5. CD3免疫组化染色。
（A）给予CAR-ΔPSMA T细胞的实验组。（B）给予Blank T细胞的对照组。（C）给予PBS的对照组。
图6. 与空白T细胞相比，CAR-ΔPSMA T细胞杀伤能力的验证。
（A）H&E染色，（B）CD45与（C）Ki67细胞增殖染色。（D）体外IFN-γ与TNF-α分泌功能验证。（E）外周血与肿瘤流式检测CD3+ T细胞的含量。
研究小结
我们攻克细胞构建的难点，选择应用广泛、易于临床转化的[68Ga]Ga-PSMA-617探针，初步验证其对CAR-ΔPSMA T细胞示踪的灵敏度与特异性。成功在体内实现长时程监测CAR-T细胞。本研究期待为未来CAR -T细胞治疗监测与患者管理提供核医学解决方案。
主要作者介绍
通讯作者
兰晓莉，医学博士、二级教授、主任医师、博士生导师。现任华中科技大学协和医院核医学科及教研室主任、分子影像湖北省重点实验室主任、生物靶向治疗教育部重点实验室副主任、华中科技大学医学影像系副主任。社会任职包括中华医学会核医学分会常委兼秘书长、中国核学会核医学分会副理事长、中国医学影像技术研究会核医学分会副主委等。荣获“国家万人计划创新领军人才”、“国家卫生健康有突出贡献中青年专家”荣誉称号。担任Eur J Nucl Med Mollmaging 副主编， Mol Pharm、Am J NuclMed Mol lmaging 编委等。在科研方面，致力于多模态分子成像及新型核医学分子影像探针开发与临床转化。发表学术论文200余篇，获国家自然科学基金重点项目2项、面上项目4项等20余项资助。
雷萍，医学免疫学博士，教授，华中科技大学免疫学系博士研究生导师，德国海德堡大学访问学者。主要研究方向为肿瘤免疫、抗体工程与免疫调节。主持国家自然科学基金青年项目、国家高技术研究发展计划(863计划)与国家自然科学基金面上项目。发表SCI论文多篇。
第一作者
宋祥铭，华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科博士研究生（在读）。以第一或共同第一作者发表SCI论文3篇。主要从事核医学报告基因显像无创示踪CAR-T细胞研究与核医学双靶点肿瘤显像研究。
张怡蕊，华中科技大学同济医学院基础医学院免疫系博士研究生（在读）。以第一或共同第一作者发表SCI论文3篇。主要从事CAR-T细胞研究与肿瘤免疫治疗研究。
